此次實驗便是應用了ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養板上分析MCF-7細胞遷移實驗的詳細方案,為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案,并進行測試了五種不同濃度的人表皮生長因子(hEGF)對遷移行為的影響并與對照條件進行比較。
實驗工作流程:
3.1 步驟1:細胞接種
正確的接種濃度是一個關鍵參數,因為24小時后應達到匯合的單層。需要進行預實驗以確定所用細胞系的最佳濃度。
1. 取下附在μ-Plate底部的保護膜。
2. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將MCF-7細胞懸浮液調節至細胞濃度為5×105細胞/ml。
3. 將70μl細胞懸浮液應用于2孔的培養插件每個孔中。避免搖動μ-Plate,因為這會導致細胞分布不均勻。
4. 將細胞在37°C和5%CO2培養至少24小時。
圖2在開始細胞接種步驟(A)之前取下保護膜。將70μl細胞懸浮液填充到2孔培養插件(B)的每個孔中。
3.1 步驟2:劃痕形成
μ-Plate 24 Well的使用并行測試五種不同的hEGF濃度和對照條件。每種實驗條件可以進行四次技術重復.
1. 在顯微鏡下觀察培養24小時后的細胞密度。如果24小時后未達到融合細胞單層,則將μ-Plate于細胞培養箱中再培養幾個小時。定期檢查匯合點。
2. 將生長因子添加到細胞培養基中以獲得以下濃度:0,5,10,20,30和40ng / ml EGF。
3. 用無菌鑷子輕輕取出2孔培養插件。要移除培養插件,請抓住一個角,如圖3所示。
4. 用無細胞培養基或PBS洗滌細胞層以除去細胞碎片和未附著的細胞。
5. 小心吸出無細胞培養基或PBS。
6.用移液管將1ml細胞培養基加到24孔板的每個孔中。
圖3使用無菌鑷子取出2孔培養插件
3.1 步驟3:獲取顯微鏡圖像
我們建議錄制延時視頻,以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。
1. 將μ-Plate 24孔培養板放在顯微鏡上并確定所有24個孔的位置。
2. 在接下來的幾個小時內多次拍攝圖像,開始觀察過程。在24小時內每30分鐘拍攝一次圖像。
4.結果
分析顯微圖像以獲得關于培養細胞遷移特征信息。分析細胞覆蓋區域隨時間的變化來確定細胞速度。
圖4 hEGF對MCF-7細胞遷移行為影響的比較。測試了四種不同的EGF濃度,并與對照實驗進行了比較。
使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養板上進行測試六種不同(或更多)的條件。通過比較細胞速度與對照條件的速度來分析五種不同hEGF濃度(每種重復四次)的影響。實驗數據顯示,與對照組相比,hEGF增加了MCF-7細胞的細胞速度。如圖4所示,hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細胞速度沒有進一步增加。