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ibidi|血管生成實驗實驗裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析操作

更新時間:2022-09-16   更新時間:2022-09-16   點擊次數(shù):1373次

ibidi血管生成實驗實驗裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析操作

微信圖片_20220915112848.jpg

  µ-Slide 血管生成載玻片


  1.選擇正確實驗方案  

  進(jìn)行血管形成分析的第一步是確定實驗方案。需要考慮三個最重要的考慮因素,分別是:  

  · 細(xì)胞類型——內(nèi)皮細(xì)胞中生理性地觀察到管形成 

  · 凝膠基質(zhì)——它需要與細(xì)胞相容,并且必須為細(xì)胞附著提供結(jié)合基序  

  · 培養(yǎng)基成分(要求生長因子) 

 

  2.實驗前工作  

  在開始篩選實驗之前,務(wù)必要做優(yōu)化實驗程序和設(shè)置。

  

  2.1. 實驗裝置的優(yōu)化  

  細(xì)胞接種密度、數(shù)據(jù)采集時間點和血清濃度對數(shù)據(jù)值有很大影響。因此,創(chuàng)建嚴(yán)格對于生成可重復(fù)的數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)集之間的可比性至關(guān)重要。

  

  2.1.1. 測量時間間隔

  首先,選擇細(xì)胞濃度和促進(jìn)血管形成的設(shè)置來記錄時間曲線。對于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 每孔約 10,000 個細(xì)胞,使用具有減少生長因子的基質(zhì)膠TM值和不含血清或生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基就足夠了。

  

  接下來,按照應(yīng)用說明制備凝膠和細(xì)胞懸液,“ibidi µ-Slide 血管生成的形成分析"。在凝膠表面播種細(xì)胞后,立即將載玻片放入顯微鏡的培養(yǎng)室中,并開始延時記錄。每 10 分鐘記錄一張圖像,使用基于軟件的工具在每個時間點調(diào)整焦點。或者,如果您的顯微鏡上沒有孵化室,則每小時記錄一次圖像,至少在前 8 - 10 小時內(nèi)。記錄每個圖像后立即將樣品放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在過夜培養(yǎng)后記錄最終圖像。

  

  最后,分析圖像并使用合適的軟件可視化曲線。參數(shù)(例如,總管長)的時間曲線通常如下圖所示。曲線上升到最大值(約 5 小時),然后下降到平均期(約 7 小時開始),然后慢慢變平(> 20 小時)。由于所有四個關(guān)鍵參數(shù)的特征看起來相似,只評估一個參數(shù)就足夠了。我們選擇管總長度作為參數(shù),因為原始圖像提供了一個控制,可以輕松地與評估圖像進(jìn)行比較。

  

3.png

  24小時內(nèi)管長的時間響應(yīng)

  

  最佳結(jié)果出現(xiàn)在最大階段以及不會迅速下降的穩(wěn)定階段。在上例中,4 小時時間點和 10 小時時間點是很好的測量參考點。

  

  2.1.2. 細(xì)胞接種密度  

  要確定最佳細(xì)胞接種密度,請記錄細(xì)胞系的特征。

  

  首先,在 5-40 x 10 3cells/ml 范圍內(nèi)進(jìn)行一系列稀釋,然后將細(xì)胞接種到凝膠表面。按照第 4.1.1 節(jié)中的說明將樣品孵育確定的時間長度,并記錄相襯圖像。每個細(xì)胞濃度執(zhí)行五次重復(fù)。

  

  評估圖像,分別在第 3 節(jié)和第 5 節(jié)中提到。將數(shù)據(jù)可視化為圖表,如下所示。數(shù)據(jù)將顯示具有最大值的特性曲線。該最大值是您的細(xì)胞類型的*佳接種密度。

  

4.png

  HUVEC 和 EA.hy926接種4小時后的密度響應(yīng)

  

  2.1.3. 血清濃度  

  向培養(yǎng)基中添加血清可能會影響試管形成行為。在大多數(shù)情況下,血清抑制管形成。為避免此問題,請使用您在第 4.1.1 節(jié)和第 4.1.2 節(jié)中確定的條件測試不同的血清濃度,范圍為 0 - 20%。這將確定哪種血清濃度合于血管生成和細(xì)胞存活。

  

  2.1.4. 放大倍數(shù)  

  放大倍數(shù)決定了能夠被相機(jī)成像的孔區(qū)域。由于管的形成發(fā)生在孔的整個表面區(qū)域,重要的是盡可能地對最寬的部分進(jìn)行成像。如果不需要檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)節(jié),請使用低倍率(4 倍或 5 倍)。如果需要檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)節(jié),建議對每個孔拍攝幾張放大倍數(shù)更高的圖像并將它們拼接在一起

  

  2.2. 建立陽性和陰性對照  

  要創(chuàng)建陽性對照,請選擇確保血管形成的實驗系統(tǒng)(例如,具有減少生長因子的基質(zhì)膠TM值和用于 HUVEC 的無血清培養(yǎng)基)。陽性對照確保細(xì)胞是健康的,并且觀察到的任何抗血管生成作用都是由所研究的物質(zhì)引起的。

  

  要創(chuàng)建陰性對照,請選擇一種經(jīng)證實對血管形成發(fā)展具有抑制作用的物質(zhì)(例如,用于 HUVEC 的蘇拉胺)。陰性對照確保可以抑制細(xì)胞中的管形成,并為您的實驗結(jié)果提供一個比較點。

  

  2.3. 實驗計劃和重復(fù)次數(shù) 

  在進(jìn)行實驗之前,計算所需材料的數(shù)量,例如細(xì)胞、培養(yǎng)基、凝膠基質(zhì)和物質(zhì)。還要計算實驗室設(shè)備和空間要求以及時間表。

  

  為了正確地進(jìn)行統(tǒng)計分析,建議至少進(jìn)行四次獨立實驗,每個實驗至少有 8 個單孔。所需的實驗次數(shù)取決于數(shù)據(jù)的均勻性。遵循嚴(yán)格的協(xié)議對于數(shù)據(jù)采集至關(guān)重要。

  

  對數(shù)據(jù)集執(zhí)行學(xué)生 T 檢驗。p 值 ≤ 0.05* (≤ 0.01**) 表示該模型有足夠的功效,無需額外實驗即可繼續(xù)。

  

  2.4. 文檔  

  合理的文檔包括本節(jié)中確定的所有參數(shù)。生成一個表格圖表,其中每個實驗都記錄在一列中。附錄中給出了一個例子。

  

  3.數(shù)據(jù)分析

  

  每個分析孔生成一個管長度值。然后將一個實驗(每個條件至少 8 個孔)的值相加并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于 10%。這只是一個實驗數(shù)據(jù)點。

  

5.png

  

  左圖顯示了在四個不同時間點,一種實驗條件下單孔結(jié)果的分布。右圖顯示了一種實驗條件在四個不同時間點的平均結(jié)果。

  

  為了正確穩(wěn)定的統(tǒng)計分析,每個條件至少需要四個數(shù)據(jù)點。請記住,每個數(shù)據(jù)點由 8 個單獨的孔組成。  

  

6.png

 

  單個數(shù)據(jù)點合并為一個平均值,并可以顯示在條形圖中。統(tǒng)計分析是通過學(xué)生 T 檢驗完成的,其中對不同的數(shù)據(jù)點群體進(jìn)行相互檢驗。

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